目前BNP及NT-proBNP检测存在的问题及解决方案

B型利钠肽（BNP）及N末端B型利钠肽前体（NT-proBNP）是心脏功能生物标志物，同时也是心力衰竭诊断与鉴别诊断、病情严重程度及预后评估的首选生物标志物。随着临床研究的不断深入，BNP/NT-proBNP的实验室检测和临床应用暴露出诸多问题。外部质量评估研究的数据表明，免疫分析法测量的BNP值之间存在着很大的系统性差异（最多2倍），即使是使用同一制造商的校准品和材料，NT-proBNP仍显示出低于20%的方法间差异[2][4]。

实际上BNP/NT-proBNP检测，测得的是多种混合肽段。无论是BNP/NT-proBNP检测系统间还是方法间的差异，在一定程度上可归因于外周血中有BNP、NT-proBNP和proBNP三种相关肽段，及其进一步降解或修饰的异质性肽段。

1.proBNP及聚体的影响

众所周知，BNP来源于pre-proBNP，它在N端包含一个信号肽序列。在信号肽被切割后，proBNP进一步被蛋白水解分裂成无活性的N端片段和具有生物活性的肽激素BNP。裂解大部分发生在心肌细胞内部或表面，未分泌到血液中，但在循环中也发现少量完整的proBNP。研究证实心房提取物和心力衰竭患者的血浆中同时存在BNP、proBNP和NT-proBNP。

proBNP会形成聚体，proBNP的N端区域含有亮氨酸拉链状基序，在生理条件下可能诱导血浆中的肽低聚，产生proBNP的三聚体或四聚体以及NT-proBNP的三聚体。这些寡聚分子可能会掩盖BNP/NT-proBNP商业检测中使用的抗体识别表位，影响BNP和NT-proBNP的分析特异性[3]。

BNP检测试剂与proBNP间的交叉反应约为0.1%-40.0%。此外，由于BNP检测试剂使用的抗体种类较多，且不同抗体识别表位不同，导致BNP检测平台间差异达15%-50%。NT-proBNP检测与proBNP存在交叉，但不与BNP交叉。绝大多数NT-proBNP商业化检测方法采用相同的抗体和校准品，但不同平台间仍有8%-23%的差异[4]。

图1. B型利钠肽的生化表达[1]

2.BNP/NT-proBNP的异质性

2.1BNP的裂解

血浆和组织中有几种蛋白水解酶可以降解利钠肽，包括脑啡肽酶、二肽基肽酶IV、胰岛素降解酶和肽基精氨酸醛蛋白酶[2]。在体内，受损血管的腔内表面，带负电荷的表面激活凝固接触活化系统后，钾激肽激酶可能会对BNP的C端结构进行水解。在血液循环中（或采血后），BNP N端的丝氨酸和脯氨酸残基上可能会迅速发生蛋白水解，这使得BNP的降解更加敏感[3]。

2.2NT-proBNP的裂解

大多数免疫反应性的NT-proBNP明显小于NT-proBNP 1-76。迄今为止，尚未用高效液相色谱法在心力衰竭患者血浆中检测到完整的NT-proBNP（1-76氨基酸）。HPLC分析表明，循环免疫反应性的NT-proBNP具有很强的异质性，且两端都可能发生裂解，并且这种裂解在血清中比在血浆中更加明显[3]。有证据显示，NT-proBNP的N端易受到血液中发生的修饰并改变其免疫反应性，C端易被蛋白水解。但某些特定的肽表位仍显示出较高的稳定性，可用于免疫检测[1]。

2.3NT-proBNP的糖基化修饰

大多数用于NT-proBNP免疫测定的抗体都是针对其末端的。NT-proBNP中部表位不适于检测，因为中部位点易被糖基化修饰或形成低聚物，阻碍抗体与表位的结合，导致NT-proBNP检测结果偏低。有研究建议NT-proBNP检测的最佳候选表位为N端13-24和C端63-76[1][4]。

3.BNP/NT-proBNP检测的特异性

3.1BNP的检测特异性

目前BNP分析都受到proBNP循环浓度和截断BNP代谢物的影响，导致生物活性BNP 1-32浓度估计过高[2][5]。商业BNP检测试剂是基于两种单克隆抗体或单克隆抗体和多克隆抗体组合的三明治型免疫测定。通常一种抗体与二硫键形成的环结构结合，另一种抗体与BNP的C端或N端结合。二硫键介导的环结构和C端结构在血液样本中似乎是稳定的，但目前也没有数据表明BNP抗体不识别proBNP。此外，BNP（1-32氨基酸）释放进入循环后，在NH2端降解为BNP 3-32，这种降解可能会影响结合肽N端表位的抗体亲和力[3]。

3.2NT-proBNP的检测特异性

通常NT-proBNP商业免疫检测试剂使用非糖基化校准材料，且大多数抗体是针对具有潜在O-糖基化位点占用的表位。而大部分与NT-proBNP和proBNP相关的循环无活性肽是O糖基化修饰的，因此这些商业化试剂不能测量NT-proBNP相关的糖基化肽。此外，NT-proBNP检测结果还会受到完整proBNP（尤其是非糖基化）和其他短肽干扰[2]。

图2. Uniprot数据库给出的proBNP糖基化位点（P16860）

表2. BNP/NT-proBNP商用抗体的反应性[3]

3.3校准品与样品的组分差异

理论上，对于BNP和NT-proBNP分析，都要求校准品的组成与患者样品中存在的分析物相似。然而，由于这些多肽是异质的，它们在人体体液中的组成可能会有很大的变化。即使校准品在某种程度上可能类似于人体体液中存在的分析物的典型异质混合物，但它们可能只代表一种“平均”状况[3]。

4.相关解决方案

4.1识别表位

在抗体生产和免疫分析设计选择表位时，应考虑到BNP/NT-proBNP的异质性[3]。1）为降低不同BNP检测平台间的差异，避免降解短肽段的漏检，BNP 6-26区段（包含环状区在内）为最佳的抗体识别表位[4]。2）为减少糖基化的影响，NT-proBNP检测抗体的识别表位应避开糖基化区域[4]。试剂厂家应明确抗体识别的精确表位，以供参考[3]。

4.2样本采集

当测量BNP时，血液应用含有EDTA的塑料管采集。EDTA螯合可以使中性内肽酶（NEPs）失活。但BNP仍会继续降解，添加蛋白酶抑制剂（如抑酶蛋白），可稳定更长时间[3]。

4.3样本保存

如在室温下储存，BNP样品应在收集后4小时内尽快检测。或离心分离血浆，加入钾化钾素或丝氨酸特异性蛋白酶抑制剂，在4℃下冷藏。如保存超过72小时，应在-70℃下冷冻[3]。

NT-proBNP在血清、肝素化血浆和EDTA血浆中的浓度相对稳定，可在室温或4℃保存72小时，-80℃下保存一年[3]。

4.4试剂校准

目前，尚无参考物质可用，无法实现BNP/NT-proBNP标准化。试剂厂家应提供校准品的来源、种类等尽可能详尽的信息；以及材料纯度和浓度的分析文件，并提供校准曲线的描述（例如：点数、曲线或直线响应）等[3][4]。

4.5国际单位

由于缺乏对SI单位的可追溯性，建议使用ng/L代替pmol/L[3]。

4.6交叉反应性

试剂厂家应提供BNP和NT-proBNP检测与BNP 3-32的交叉反应性，以及所有NP和其他肽激素（包括proBNP及其多聚体）的交叉反应性。BNP检测应证明与BNP 3-32具有100%的交叉反应性[3]。

参考文献

[1]Harpaz D, Seet RCS, Marks RS, et al. B-Type Natriuretic Peptide as a Significant Brain Biomarker for Stroke Triaging Using a Bedside Point-of-Care Monitoring Biosensor[J]. Biosensors (Basel). 2020,10(9):107.
[2]Clerico A, Zaninotto M, Passino C,et al. New issues on measurement of B-type natriuretic peptides[J]. Clin Chem Lab Med, 2017,56(1):32-39.
[3]Apple FS, Panteghini M, Ravkilde J, Mair J, Wu AH, Tate J, Pagani F, Christenson RH, Jaffe AS; Committee on Standardization of Markers of Cardiac Damage of the IFCC. Quality specifications for B-type natriuretic peptide assays. Clin Chem. 2005 Mar;51(3):486-93.
[4]中国医师协会检验医师分会心血管专家委员会.B型利钠肽及N末端B型利钠肽前体实验室检测与临床应用中国专家共识[J].中华医学杂志,2022,102(35):2738-2754.
[5] Lewis LK, Raudsepp SD, Yandle TG,et al. Development of a BNP1-32 Immunoassay That Does Not Cross-React with proBNP[J]. Clin Chem,2017,63(6):1110-1117.

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