CEA（CEACAM5）抗体结合表位研究

癌胚抗原相关细胞粘附分子（CEACAM）包括CEACAM1、CEACAM3至CEACAM8、CEACAM16以及CEACAM18至CEACAM21，属于膜相关细胞表面的糖蛋白家族，它们在细胞粘附、信号传递及肿瘤转移过程中扮演着重要角色。这类分子在肺部、结直肠及胃部组织的某些肿瘤细胞中呈现出表达上调的现象，使其成为抗体-药物偶联物的一个极具潜力的靶标。CEACAM的胞外结构域（ECD）由重复的免疫球蛋白（Ig）样结构域组合而成，包含一个位于N端的免疫球蛋白可变（IgV）样结构域，以及数量可多达六个的免疫球蛋白恒定C2（IgC2）样结构域（分为A型和B型）。这些结构域在不同类型的CEACAM之间展现出了高度的序列一致性和结构相似性。此外，CEACAM的ECD还包含多达28个潜在的N-糖基化位点。糖基化的差异性对蛋白-蛋白相互作用及疾病发展进程具有显著影响。因此，为防止临床诊断时出现假阳性结果，或在免疫治疗中引发脱靶效应或靶外肿瘤毒性，CEACAM靶向抗体必须具备高度的特异性，以避免与其他类型的CEACAM发生交叉反应。

1.CEACAM5特异性抗体

Tusamitamab ravtansine（SAR408701）是一种针对CEACAM5（即CEA）的抗体-药物偶联物，用于治疗晚期非鳞状非小细胞肺癌（NSCLC）和其他实体肿瘤。其抗体成分tusamitamab靶向CEACAM5的A3-B3结构域，不与CEACAM1、CEACAM6或CEACAM8结合，这意味着A3-B3结构域表面存在独特的结合区域，赋予抗体特异性。

2.抗体抗原结合界面分析

为了了解tusamitamab与CEACAM5_A3-B3的结合机制和特异性，研究人员采用了多种方法对结合界面进行了残基鉴定和结构分析。

2.1研究方法

1）利用低温电子显微镜（cryo-EM）描述CEACAM5 A3-B3结构域与tusamitamab抗原结合片段（tusa Fab）复合物的高分辨率结构。
2）通过表面等离子体共振（SPR）分析丙氨酸突变对CEACAM5与tusa Fab结合的影响，进一步表征结合界面。
3）通过氢-氘交换耦合质谱（HDX-MS）比较CEACAM5与tusa Fab结合前后氢-氘交换的差异，鉴定表位残基。

2.2研究结果

2.2.1cryo-EM结构分析

1）糖基化

tusa Fab和hCEACAM5_A3-B3的结构完全由β链和β片组成（图1b）。hCEACAM5的A3和B3结构域具有典型的IgC2结构域β-三明治结构。研究人员在hCEACAM5_A3-B3区域鉴定了7个聚糖，包括Asn612残基上的N-连接甘露糖，该甘露糖与tusa Fab重链Gly54和Gly56残基形成氢键（图1c）。

2）结合界面

hCEACAM5-tusa Fab结构揭示了tusa Fab的重、轻链与hCEACAM5_A3-B3（主要在B3区）的结合。
A.重链结合界面
hCEACAM5-tusa Fab重链结合界面的掩埋表面积覆盖455Å2，涉及hCEACAM5 B3结构域的12个残基（Pro621至Ser626、Gln635至Val639和Phe641）和14个tusa Fab重链残基（Val28、Ser30至Asp33、Ser53和His99至Pro106）。

在这个界面中检测到一个由8个氢键组成的网络，有的氨基酸会形成多个氢键。特别是，tusa Fab重链残基Ser31与3个hCEACAM5残基（Gln635、Thr637和Val639）；tusa Fab重链残基Ser104与3个hCEACAM5 残基（Ser622和Gln624）；CEACAM5 Ser622与2个tusa Fab重链残基（Ser103和Ser104）。

虽然界面中的一些残基存在疏水效应，但大多数残基距离太远无法相互作用（>5 Å）。只在hCEACAM5 Phe641和tusa Fab重链Val28之间发现了1个潜在的疏水作用位点，残基间距为~4.2 Å。

B.轻链结合界面
hCEACAM5-tusa Fab轻链界面的掩埋表面积达到344 Å2，涉及12个hCEACAM5氨基酸（A3结构域：Asn509、Lys511、Val513、Asp588和Leu590；B3结构域：Pro621、Ser622、Gln624、His636、Asn659、Leu660、Ala661）和9个tusa Fab轻链氨基酸（Glu27、Asn28、Phe30、Ser31、Tyr32、Tyr49、Asn50、His91、Tyr92）。hCEACAM5残基Leu660、Lys511和Gln624分别与tusa Fab轻链残基Tyr32、Tyr92和Asn50形成氢键。

此外，该界面有一个疏水区，涉及4个hCEACAM5残基（Pro621、Leu590、Leu660和Ala661）和3个tusa Fab轻链残基（Phe30、Tyr32和Tyr92），这些残基在3.7 Å和4.7 Å距离上具有正ΔG_solv值。

值得注意的是，hCEACAM5 B3结构域中的Gln624与tusa Fab重链和轻链残基均形成氢键。hCEACAM5_A3-B3和tusa Fab之间的结合界面相互作用不涉及盐桥或二硫键（图2）。

图1. hCEACAM5_A3-B3与tusa Fab复合物的低温电镜结构

注：BMA：β-d-甘露糖；CDR_H2：互补决定区重链2；CEACAM5：癌胚抗原相关细胞粘附分子5；cryo-EM：低温电镜；FUC：α-l-果糖；hCEACAM5：人癌胚抗原相关细胞粘附分子5；hCEACAM5_A3-B3：人癌胚抗原相关细胞粘附分子5的A3-B3结构域；Man：α-d-甘露糖；NAG：N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖；tusa Fab：tusamitama抗原结合片段。

hCEACAM5_A3-B3与tusa Fab结合的Cryo-EM图谱。a.中右图为左图在纵轴上旋转90°视图。b.为hCEACAM5_A3-B3（金带）与tusa Fab（洋红和蓝带）结合的带状结构示意图。箭头表示一个β链，圆棒表示N-链聚糖。c.hCEACAM5 B3（金带）结构域Asn612残基上的N-连接甘露糖与tusa Fab重链（洋红带）之间相互作用的放大视图。图中tusa Fab重链CDR_H（蓝色）Gly54、Gly56与聚糖（深灰色）之间的相互作用用虚线表示。聚糖片段周围的线网表示模型与低温电镜密度图的拟合结果。d.分子操作环境（MOE）生成的聚糖配体相互作用图。hCEACAM5的相互作用残基用圆圈表示，A和B分别表示A3和B3结构域的残基。

图2.hCEACAM5_A3-B3与tusa Fab相互作用的关键表位

注：CDR_H：重链互补决定区；CDR_L：轻链互补决定区；hCEACAM5：人癌胚抗原相关细胞粘附分子5；hCEACAM5_A3-B3：人癌胚抗原相关细胞粘附分子A3-B3结构域；tusa Fab：tusamitama抗原结合片段。

hCEACAM5的主架和侧链呈灰色。a.图中tusa Fab的CDR_H1（洋红色）和CDR_H3（黄色）通过与CEACAM5的B3结构域形成氢键网络来促进相互作用；虚线表示氢键。CDR_H3的残基主要在CDR_H3的Ser104、Ser103和Phe101与hCEACAM5 B3结构域的Ser622、Gln624和His636之间形成强氢键相互作用网络。CDR_H1残基Ser31与hCEACAM5 B3结构域的Gln635、Val639和Thr637形成氢键。b.CDR_L1（青色），CDR_L2（珊瑚色）和CDR_L3（绿色）与hCEACAM5_A3-B3结构域相互作用。CDR_L1的Tyr32、CDR_L2的Asn50和CDR_L3的Tyr92分别与hCEACAM5_A3-B3结构域的Leu660、Gln624和Leu511形成氢键。

2.2.2SPR分析

在初始筛选中，重链上的5个变体（Asp33Ala、Phe101Ala、Gly102Ala、Gly105Ala和Pro106Ala）和轻链上的2个变体（Tyr32Ala和Asn50Ala）完全失去与hCEACAM5_ECD的结合能力；重链中的4个变体（Tyr32Ala、Tyr50Ala、His99Ala和Tyr100Ala）和轻链中的4个变体（Phe30Ala、His91Ala、Tyr92Ala和Pro95Ala）与hCEACAM5的结合减弱。

此外，重链中的7个变体（Tyr32Ala、Asp33Ala、Tyr100Ala、Phe101Ala、Gly102Ala、Gly105Ala和Pro106Ala）和轻链中的2个变体（Tyr32Ala和Asn50Ala）完全破坏了hCEACAM5tusa Fab+Fc复合物的稳定性。重链中的另外两个变体（Tyr50Ala和His99Ala）和轻链中的4个变体（Phe30Ala、His91Ala、Tyr92Ala和Pro95Ala）导致复合物稳定性降低。

综上所述，这些发现表明tusa Fab抗体结合区包含重链的第三个互补性决定区（CDR3）（残基96-108）。来自重链CDR1（残基32和33）、轻链CDR1（残基32）和轻链CDR3（残基91和92）的一些残基也可能有助于抗体结合区相互作用。

在第二组SPR实验中，选择在SPR筛选实验中%Rmax和%Remaining与野生型（WT）不同的20个tusa Fab+Fc变体，进行进一步评估。值得注意的是，相对于tusa Fab+Fc WT（K_D=14.0nM），重链中的2个变体（Tyr50Ala和His99Ala）和轻链中的4个变体（Phe30Ala、His91Ala、Tyr92Ala和Pro95Ala）与hCEACAM5_ECD的结合亲和力降低（K_D=306.5nM至13.5µM）（表1）。

表1.利用SPR分析丙氨酸突变对hCEACAM5与tusa Fab+Fc结合的影响

注：k_a：结合常数，k_d：解离常数，K_D：结合常数，t_1/2：解离半衰期，WT：野生型。
a.野生型tusa Fab和丙氨酸变体之间结合自由能变化（构象稳定性）的差异（ΔGWT -ΔGAla）。负值表明丙氨酸突变在能量上是不利的（即，需要比WT蛋白更多的能量来折叠）。

2.2.3HDX-MS分析

游离CEACAM5和CEACAM5-tusa Fab复合物氘摄取的差异表明CEACAM5表位涉及残基607-613和629-641。游离tusa Fab和CEACAM5-tusa Fab复合物氘摄取的差异表明tusa Fab结合表位涉及重链中的101-109残基和轻链中的48-54和88-104残基。

2.2.4小结

通过多种方法（cryo-EM，SPR和HDX-MS）鉴定出tusa Fab 表位中16个氨基酸残基（10个在重链上，6个在轻链上）（图3a）。当发生丙氨酸突变时，6个残基（重链：Tyr32、Asp33、Tyr100和Phe101；轻链：Tyr32和Asn50）与hCEACAM5_A3-B3结合能力丧失，2个残基（轻链：Phe30和Tyr92）的结合能力变弱。

通过丙氨酸诱变鉴定的Tusa Fab表面残基大多与cryo-EM鉴定的残基一致（图3b）。综合来看，当聚集在低温电镜核心区域的残基突变为丙氨酸时，会导致与hCEACAM5结合能力丧失，而当距离更远的残基突变为丙氨酸时，会导致结合变弱。HDX法鉴定的hCEACAM5表位比低温电镜法鉴定的表位表面积小；然而，这两种方法检测到的相互作用核心区域都在B3结构域（图3c）。

图3.hCEACAM5_A3-B3与tusa Fab结合界面的不同分析技术鉴定结果

注：Ala-Scan，丙氨酸扫描诱变；Ala+SPR，丙氨酸变体的表面等离子体共振；cryo-EM，低温电子显微镜；HC，重链；hCEACAM5，人癌胚抗原相关细胞粘附分子5；hCEACAM5_A3-B3，人癌胚抗原相关细胞粘附分子5的A3-B3结构域；HDX，氢-氘交换；LC，轻链；MAN，甘露糖；tusa Fab，tusamitamab抗原结合片段。

a.hCEACAM5_A3-B3与tusa Fab复合物中相互作用残基的比较。氢键用虚线表示。b.通过丙氨酸诱变鉴定的tusa Fab表位残基（黄色高亮表示部分结合，红色高亮表示没有结合）和冷冻电镜（浅粉色高亮表示重链的相互作用残基，洋红色高亮表示轻链的相互作用残基）的比较，tusa Fab重链和轻链的溶剂可溶表面分别用浅棕色和浅蓝色表示。c.HDX（红色）和cryo-EM（洋红色）鉴定的hCEACAM5表位残基比较。hCEACAM5_A3-B3和N-链聚糖的溶剂可溶表面分别为金棕色和浅棕色。b，c二级结构（较深的带状结构和球棍结构）。

2.3讨论

CEACAM蛋白家族中，CEACAM5独特表位的确定对理解其特异性结合至关重要，特别是A3-B3结构域的表位，对抗体-药物偶联机制具有重要意义。本研究通过cryo-EM、HDX-MS和SPR鉴定获得的CEACAM5_A3-B3与tusamitamab（tusa Fab）结合表位基本一致。其中tusa Fab结合表位中的16个氨基酸残基与抗体特异性、亲和力有关。这些残基多属于芳香残基（Tyr、Trp和Phe）、短亲水侧链残基（Ser、Thr、Asp和Asn）或甘氨酸。这些残基聚集在重链上（特别是CDR3），通过氢键或范德华力稳定结合界面。16个残基中有6个突变为丙氨酸时，与hCEACAM5_A3-B3结合能力丧失，2个突变后结合能力变弱。

hCEACAM5表位涉及A3和B3结构域；Tusa Fab主要结合B3结构域，与A3作用较少。hCEACAM5 B3结构域主要涉及6个残基（Ser622、Gln624、Gln635、His636、Thr637和Val639），特别是Gln624能同时与重链和轻链形成氢键。4个氢键残基（Gln635、His636、Thr637和Val639）和1个疏水残基（Phe641），可能对hCEACAM5表位至关重要。

此外，在B3结构域Asn612残基上的N-连接甘露糖与tusa Fab重链形成氢键。N-糖基化倾向于降低蛋白质的灵活性，增加蛋白质的整体稳定性。因此，hCEACAM5_A3-B3中的所有N-连接聚糖，包括与Asn612连接的聚糖，可能在形成被tusa Fab和其他参与hCEACAM5细胞功能的蛋白质识别的整体构象中发挥重要作用。聚糖在CEACAM5中的作用很重要，因为在hCEACAM5-tusa Fab结合界面中没有盐桥。盐桥通过施加限制构象灵活性约束在抗体-抗原相互作用中发挥重要作用。Asn612残基上的N-连接甘露糖可能具有补偿和稳定功能，类似于没有盐桥的蛋白质复合物中的关键锚定残基；这将增加结合界面的刚性，从而提高tusa Fab对hCEACAM5_A3-B3的特异性。

研究人员推断，tusa Fab对hCEACAM5的A3-B3结构域的特异性是由于tusa Fab重链和轻链与hCEACAM5_A3-B3之间存在多种类型的相互作用，以及结合界面的构象约束（形状互补）。这种结合机制可能使tusamitamab能够将hCEACAM5与其他人类CEACAM（即CEACAM1、6和8）区分开，并将hCEACAM5中的A3-B3结构域与A1-B1和A2-B2结构域区分开。

参考文献

Kumar A, Duffieux F, Gagnaire M, et al. Structural insights into epitope-paratope interactions of a monoclonal antibody targeting CEACAM5-expressing tumors[J]. Nat Commun, 2024, 15(1):9377.

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