甲胎蛋白（AFP）的糖基化及配体结合

甲胎蛋白（AFP）是一种69 kDa的胎儿血清糖蛋白，主要在胎儿肝脏和卵黄囊中合成，半衰期为4-5天。除了妊娠期AFP水平较高外，肝癌患者血浆中AFP浓度也较高，被公认为最早发现的肿瘤标志物之一。越来越多的证据表明AFP在肝细胞癌（HCC）的发生发展中起着重要的生物学作用。AFP促进HCC细胞增殖、侵袭和转移，抑制细胞凋亡，增强干性基因的表达。这些恶性功能是通过cAMP-PKA、RA-RAR、Caspase3、PTEN、PI3K/AKT/mTOR等信号通路激活或抑制下游靶基因表达而实现的。AFP还具有免疫抑制功能，例如，AFP抑制DC线粒体代谢，诱导DC凋亡，增强NK细胞的细胞毒性，改变CD4⁺/CD8⁺ T细胞的比例，从而抑制T细胞介导的细胞毒性。此外，AFP影响巨噬细胞分化和吞噬活性。AFP通过参与免疫调节，促进HCC细胞的免疫逃逸。

1. AFP的糖基化特征

AFP的糖蛋白变异最初是用神经氨酸酶和刀豆蛋白A鉴定和分离的。随后通过各种凝集素确定了甲胎蛋白中的糖链类型，并发现妊娠和肿瘤发生期间甲胎蛋白的聚糖组成不同。1990年，研究人员利用氢核磁共振（1H-NMR）技术成功鉴定了AFP糖肽结构。质谱和相关技术的进步促进了AFP糖肽类型的有效鉴定，促进了AFP作为肿瘤标志物的发展。

1.1 AFP的糖基化修饰位点

N链糖基化是一种共翻译或翻译后修饰，其中糖链连接到特定的天冬酰胺残基上，具有一致的氨基酸序列N-X-S/T，其中X代表除脯氨酸以外的氨基酸。研究人员在AFP的Asn251中检测到一个额外的电子密度图。AFP中N251周围的氨基酸序列为TKVNFTEIQ，符合N-链糖基化标准，因此推测这种密度就是糖链结构。SDS-PAGE分析观察到AFP丝氨酸（N251S）突变成天冬酰胺后具有更高的电泳迁移率（图1b），表明该突变导致糖基化丧失，降低了AFP的分子量，这进一步证实了该密度为糖基化修饰。

1.2 天然与肿瘤源性AFP的糖基化差异

对正常HEK 293F细胞和肝癌细胞Bel7042提取的AFP（293-AFP和7402-AFP）进行糖基化质谱分析。结果表明，AFP在残基N251上的N链糖基化组成不同。两种细胞系AFP的多糖组成均含有浓缩多糖，浓缩多糖的比例均超过总多糖的75%。这表明来自两种细胞系的AFP都倾向于AFP-L3，AFP-L3的特点是在其聚糖链的N-乙酰氨基葡萄糖还原端有一个α-1,6-聚焦残基。两种细胞系来源的AFP主要聚糖组成不同，293-AFP的主要聚糖组成为HexNAc(5)Hex(4)Fuc(1)，占26.82%，而7402-AFP的主要聚糖组成为HexNAc(4)Hex(5)Fuc(1)，占44.44%。

肿瘤源性AFP（tAFP）和脐带天然AFP（nAFP）糖基化的主要区别在于核心多糖是否与岩藻糖残基相连，nAFP通常缺乏岩藻糖残基，但也有特例。AFP聚糖组成的差异可能最终导致功能差异，例如肿瘤源性AFP（tAFP）可直接诱导NK细胞和DC细胞凋亡。

图1. AFP的N-糖基化

注：a.一个连接到AFP Asn251的附加电子密度图。密度图根据AFP子域进行颜色编码，额外电子密度图用红色标记。AFP序列符合N链糖基化序列模式。b. AFP和突变AFP（N251S）的SDS-PAGE分析。c. AFP的寡糖结构。这种低聚糖被称为β-D-甘露吡喃糖-(1-4)-2-乙酰氨基葡萄糖-2-脱氧-β-D-葡萄糖吡喃糖-(1-4)-2-乙酰氨基葡萄糖- 2-脱氧-β-D葡萄糖吡喃糖。

2. AFP的金属离子结合

2.1 金属离子结合位点

金属离子通过参与氧化还原反应、电子转移、酶催化和蛋白质结构稳定等各种过程，在生物系统中发挥着至关重要的作用。研究人员在AFP IA结构域中，发现了一个金属离子结合位点，涉及四个氨基酸His22、His264、His268和Asp280（图4a）。有趣的是，金属离子并非在蛋白质提取过程中引入的，电子密度图表明在培养基中就存在AFP与金属离子的结合。

将AFP的4个氨基酸突变为丙氨酸，得到突变体AFP-4mut（H22A、H264A、H268A和D280A）。在此之后，使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）评估金属离子与野生型AFP和突变型AFP-4mut蛋白的结合。结果表明，突变体AFP-4mut中金属与蛋白质的摩尔比降低，特别是镁、铝、镍和锌等元素（图2a）。这意味着AFP中鉴定的四种氨基酸具有结合不同类型金属离子的能力。

2.2 AFP的金属离子结合模式

研究发现，在AFP的结构中有一种有趣的金属离子结合模式，这与Cu、Zn-SOD（PDB：5K02）中观察到的一致（图2）。AFP与Cu，Zn-超氧化物歧化酶 （Cu，Zn-SOD） 在结合铜离子和显示超氧化物歧化酶活性的能力方面具有相似之处。这表明AFP具有多种功能，不仅促进金属离子传输，而且还可能与调节血液中氧化还原反应的平衡有关。

此外，一些金属元素与AFP的摩尔比超过1，这表明AFP可能在多个位置与金属离子结合。选择Zn²⁺拟合到密度图中（图3a），发现它与His22、His264、His268和Asp280呈四面体配位（图2b）。通过CheckMyMetal服务器分析键长和金属配位（图2c），锌离子到3个氮原子和1个氧原子的平均距离分别为2.35 Å和2.45 Å。一些参数，如Valence和nVECSUM不理想，可能是由于在该结合位点结合多个金属离子。该基序为AFP提供了很强的金属离子结合能力。His22与Zn²⁺的配位进一步稳定了AFP的N端环结构。胎生动物和卵生动物AFP的金属离子结合基序，在序列保守性上存在差异（图3c）。这表明AFP在金属离子结合中的功能作用存在潜在的进化差异。

先前的研究表明，AFP对Zn²⁺ 的亲和力高于人血清白蛋白（HSA），这可归因于结构差异，包括存在参与结合的额外组氨酸残基。甲胎蛋白是妊娠期间的主要运输载体。与HSA相比，AFP对金属离子具有高亲和力的一种可能解释是它需要穿过胚胎-胎儿屏障。此外，从进化的角度来看，AFP的金属离子结合基序在胎生动物中表现出更大的保守性（图3c）。与卵生动物相比，胎生动物的胎儿需要穿过胎盘屏障才能从母体获取必需的营养物质，因此需要更强的亲和力。

图2.金属离子含量检测及结构验证

注：a.用ICP-MS测定AFP中金属的含量。直方图的横轴表示金属元素。一些含量较低或添加的元素不显示。纵轴表示金属与蛋白质的摩尔比。AFP-4mut表示四种突变：H22A、H264A、H268A、D280A。AFP-4mut与金属的摩尔比减小表明金属与AFP结合。b.描绘Cu、Zn-SOD（5K02，深青色）和AFP（8X1N，粉色）中金属离子结合位点的原子模型。黄色虚线表示离子到残留物的距离。c. CheckMyMetal服务器验证AFP-Zn²⁺。网站地址：https://cmm.minorlab.org/，PDB代码：8X1N。

图3.AFP金属离子结合位点分析

注：a.甲胎蛋白Zn²⁺和Zn²⁺结合位点的原子模型和低温电镜密度。Zn²⁺结合残基用洋红色棒状表示，Zn²⁺用灰色球状表示。密度用黑色网格表示。b. AFP与HSA中Zn²⁺结合位点的结构比较。AFP（洋红色）和HSA-Zn²⁺配合物（5IJF，绿黄色）重叠，结构域I对齐。锌离子为灰色，氧为红色，氮为深蓝色。金属离子结合位点用黑色三角形表示。不变残基和高度保守残基分别用红色阴影和红色字母表示。

3. AFP与脂肪酸的结合

在AFP模型中，某些区域表现出不同的密度图，表明是独立结合的配体，初步推测这些是AFP的天然结合脂肪酸。GC-MS结果表明，与AFP结合的FA中，棕榈酸（C16:0）含量最多（图4a），占总FA的57.42%。棕榈酸的大小与这些密度一致（图4b）。

3.1 AFP的FA结合位点

FA结合位点分别位于AFP亚结构IIA、IIA/IIB、IIIA和IIIB，根据氨基酸序列顺序命名为FA结合位点-1/2/3/4。FA在结合位点1处，与AFP的IIA亚结构相互作用。与FA的相互作用主要涉及5个螺旋氨基酸残基，FA链多被疏水性氨基酸包围。FA羧基的取向由带正电的极性氨基酸Lys242和Lys246决定，而His266和Met285则有助于形成s形FA构象。FA结合位点-2位于AFP亚结构IIA和IIB之间的界面，位于由四个α螺旋形成的浅槽内。三个氨基酸残基Arg233、Asn348和Gln378作为锚点将FA固定在这个结合位点上。在FA结合位点3处，FA呈U型弯曲，完全占据AFP亚结构IIIA内的结合袋。在FA下方，Glu474与Arg372、Ser408和Arg500之间形成氢键，与其他氨基酸形成半封闭的口袋，这可能是导致FA链不能向下延伸的原因。FA的羧酸基团可能与Tyr435、Lys438和Ser513残基相互作用。FA结合位点-4由横跨子结构域IIIB的疏水通道形成。FA在袋内呈线性延伸。一些极性氨基酸，包括Tyr425、Tyr426、Asn429和Lys549决定了FA羧基的位置。

3.2 AFP的结合特性

AFP的疏水性分析表明，蛋白质的整体外表面是亲水的，有利于其存在于血液中。相反，FA结合口袋为疏水表面，使其适合与疏水分子（如FA）相互作用（图5a）。此外，AFP表面的负电荷比例较高，这有助于其较低的等电点。值得注意的是，大多数带正电的氨基酸侧链位于FA结合口袋的入口，特别是精氨酸和赖氨酸，可能有助于锚定带负电荷的FA羧基（图5b）。

此外，使用NanoTemper Tycho NT.6测试蛋白质的热稳定性，发现脱脂AFP的热稳定性下降。然而，重新引入FA后，其恢复原有的热稳定性（图4c），说明FA的结合促进了AFP的热稳定性。

图4.AFP的脂肪酸结合位点

注：a.AFP中脂肪酸的GC-MS分析。左图显示脂肪酸标准品的色谱图。右图为从AFP中提取的脂肪酸色谱图，主要峰为棕榈酸（C16:0）和硬脂酸（C18:0）。所有离子均经串联质谱确认。b.AFP中脂肪酸（FA）结合位点的整体和细节特征。左图显示了FA在AFP结构中的密度图和原子结构的空间定位。右图标注了与FA相关的氨基酸。FA是棕榈酸（C16:0），呈紫色。c.采用无标记热移法检测AFP的热稳定性。左图是在没有和存在给定肉豆蔻酸（MYR）的情况下，通过330 nm荧光发射得到的甲胎蛋白和脱脂甲胎蛋白的熔化曲线，右图是这些痕量的一阶导数。弯曲温度（Ti）表示为三个独立测量的平均值±SE。

图5.AFP的疏水性和静电势面分析

注：a. AFP中脂肪酸结合袋的疏水性。b. AFP显示在平面图中，并根据其库仑势着色。位于脂肪酸结合袋入口的氨基酸被标记。

众所周知，甲胎蛋白具有运输功能，能够通过胎盘将某些营养物质（FA和金属离子）从母体血液运输到胚胎细胞。研究团队分析了AFP与天然FA结合的结构特征。AFP的FA结合袋不但可以结合FA，也可能与其他小分子配体结合。体内正常细胞通常没有AFP受体，胚胎细胞、肿瘤细胞（HCC、乳腺癌、胃癌等）、增殖的肝细胞和一些免疫细胞（如髓源性抑制细胞）等细胞表面具有特异性AFP受体，它们通过其受体介导的细胞内吞作用消耗AFP。因此，AFP可以作为转运载体将药物靶向转运到肿瘤部位，而不会损伤正常细胞。计算机辅助对接技术可用于筛选对AFP结合口袋具有高亲和力的药物，通过利用AFP肿瘤靶向特性为癌症治疗带来潜在的新策略。

参考文献

Liu K, Wu C, Zhu M, et al. Structural characteristics of alpha-fetoprotein, including N-glycosylation, metal ion and fatty acid binding sites[J]. Commun Biol, 2024,7(1):505.

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