糖化ヘモグロビン（HbA1c）の検出方法

糖尿病（DM）の世界的な蔓延率は非常に高く、人間の健康を深刻に脅かしている世界的な公衆衛生問題であり、DMの予防と治療は医学研究のホットスポットです。従来のDM診断と治療検査では空腹時血糖（FBG）、食後血糖（OBG）および経口ブドウ糖負荷試験（OGTT）を使用していますが、血糖パラメータは採血時の瞬間的な血糖値のみを表しています。グリコシル化ヘモグロビン（GHb）は長期的な血糖値を反映するゴールドスタンダードとして、DM治療の検出のための重要な指標です。1985年にAllenらは、陽イオン交換クロマトグラフィーを使用して、ヒトHbAをHbAよりも負電荷がさらに多く、少なくとも3つの小さな成分に分離されたことを報告しました。しかし、当時、これらの成分とDMの関係は見つかりませんでした。HbA1cが修飾後のHbAへのグルコース結合に由来し、HbA1cとFBGの間の密接な関係、耐糖能試験のグルコースピーク値と曲線下面積、および過去数週間の平均血糖値との関係は1975年まで、徐々に気づきました。

臨床検査室で一般的に使用されるHbA1c分析方法は、2つのカテゴリに分類されます。1つは、HbA1cと非HbA1cの異なる電荷に基づき、陽イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動および等電位集束が含まれます。もう1つは、アフィニティクロマトグラフィーや免疫学的方法など、GHbグループのさまざまな構造に基づいています。

1. ラテックス凝集反応法

ラテックス凝集反応法は、グリコシル化ヘモグロビン（HbA1c）抗原とHbA1c抗体を使用して、総ヘモグロビンHb中のグリコシル化ヘモグロビン（HbA1c）の割合を直接測定します。現在、国内外のメーカー数社がHbA1c測定用のキットを提供しています。この免疫応答は、血液サンプル中の総HbおよびHbA1cと試薬中のHbA1c抗体の組み合わせによって形成され、凝集を形成します。凝集の量は、HbA1cタンパク質の濃度によって異なります。HbA1c抗原の濃度は、生物分析機器を使用した比濁分析によって測定されます。エンドポイント法が使用されます。生化学分析装置は、反応溶液の吸光度を測定することにより、凝集の量を直接反映できます。Hb中のHbA1cの割合が計算されます。機器は主に660nm単色光を主波長として使用し、800nm単色光を副波長として使用します。測定値は標準曲線から得られます。このテストの標準曲線は非線形であるため、測定の前に、まずキットに付属している5つの異なる濃度校正溶液を使用して、5ポイントの非線形標準曲線を作成します。曲線と値は生化学分析装置のリザーバーに保存され、サンプルを測定するとき、測定された吸光度値Aが検量線と比較され、機器のCPUで測定サンプル中のHbA1cの割合を計算します。ラテックス凝集反応法は便利であり、追加の機器なしでHbA1cの測定ができ、自動生化学分析を直接使用してサンプルを迅速に測定できます。この方法は、現在最も一般的に使用されている方法であり、マイクロプレートリーダーで手動で測定することもできます。しかし、ラテックス凝集反応法の精度と再現性は欠けています。

2. イオン交換高圧クロマトグラフィーHPLC

グリコシル化ヘモグロビン（high pressure liquid chromatography）の割合を測定するためのイオン交換高圧クロマトグラフィー（HPLC）の使用は、現在HbA1cを分析するためのゴールドスタンダードであると考えられています。HPLCメソッドを使用して機能する自動グリコシル化ヘモグロビン分析機器は、高速かつシンプルで、独創的、正確であり、ますます多くのユーザーに利用されています。

クロマトグラフ分析は、異なる相における混合物の成分の分布の違いを使用して、2相材料の相対移動中に混合物のさまざまな成分を分離する分析手法です。液体クロマトグラフィーは、液体または固体を固定相とし、液体を流動祖としてのクロマトグラフィーの総称です。このテクノロジーは、ライフサイエンス研究の生物活性物質の分析に使用されます。生物活性物質は混合物の形で存在します。人間の血液には何千ものタンパク質があり、混合されているタンパク質から分離しなければ、正確に測定することはできません。HbA1cの測定では、高精度HPLCを使用してHbA1cをHbから分離し、正確な値が取得できます。ライフサイエンス研究では、よく液体クロマトグラフィーを利用します。

3. グリコシル化ヘモグロビンの自動分析装置

グリコシル化ヘモグロビン自動分析装置は、イオン交換HPLCを使用してグリコシル化ヘモグロビン（HbA1c）を測定します。イオン交換HPLC法は、イオンが交換できる物質を固定相としてイオン性化合物を分離する方法です。機器は陽イオン交換カラムを使用してHbA1cのパーセンテージを測定します。サンプリング針によって一定量の全血サンプルがサンプリングデバイスに吸引されると、希釈された部分で溶血されて、希釈剤で希釈された赤血球のヘモグロビンHbが放出され、希釈されます。溶血したサンプルは高圧ポンプによりイオン交換カラムに注入されます。カラムの固定相は、新しく開発された非多孔性で不溶性で透過性の架橋ポリマーであり、固定された荷電基と対イオンがその上に分布しています。サンプルはフィルターを通して交換カラムの上部から追加された後、サンプルを下向きに移動させるために、3つの異なる濃度の塩溶出バッファー（移動相）で溶出されます。このとき、溶液に含まれるヘモグロビンHbのさまざまな成分は、固定相で可動イオンと交換されます。サンプルのヘモグロビンのさまざまな成分は、固定相で連続的に可逆交換吸着と脱着を受け、三種類の異なるイオン濃度の塩溶液は、線形勾配溶出を形成します。全自動ヘモグロビン分析装置は、Hbの複数の成分が1分以内に分離できます。このうち、HbA1c、HbF、およびHbA1は効果的かつ正確に分離されます。交換カラムから流出するHb成分は、機器の検出器に到達します。検測機械には単色光を発光する発光ダイオードを搭載し、HbA1c、HbF、HbA1の3つのパラメーターを2波長可視光比色法で測定します。機器の検出器は、分離されたHbA1c、HbF、およびHbA1コンポーネントの吸光度値を検出し、それらをHbA1c標準の吸光度値と比較し、結果を分析と計算し、最終的にHbコンポーネントの結果をパーセンテージでクロマトグラムと一緒に出力します。

イオン交換カラムHPLCメソッドは、全血中のHbA1cを直接測定し、そのバッチ内とバッチ間の変動係数CVはほとんど1％未満であり、結果は正確です。HbA1cの測定結果は、変異ヘモグロビン及びその誘導体に影響されず、糖尿病患者のモニタリングに適用です。

4. 免疫濾過法

操作は比較的簡単で、ノルウェーのNycoCardReaderIIの検出器は代表です。

5. 化学発光法

イオンキャプチャイムノアッセイ法を採用し、蛍光マーカーと相まってHbA1c抗原とHbA1c抗体反応の原理を応用し、負に帯電したポリアニオン複合体を接続することにより、正に帯電したファイバーの表面に吸着します。一連の徹底的な洗浄ステップの後に、蛍光強度の変化率を決定し、濃度を計算します。特別な試薬キットと免疫発光分析装置を使用することで、検出システムは標準化と繰り返しが簡単で、操作上の技術的エラーを減らすことができ、検出感度と特異性が高く、バッチ内およびバッチ間の変動係数が小さく、回収率と精度が高く、コンタミネーション率は小さく、影響はほとんどありません。

6. ラジオイムノアッセイ

メリット：高精度、強い特異性、高速、安価、バッチテストができ、さまざまな干渉要因に影響されません。デメリット：現在、高力価抗体の調製は困難があり、まだ研究中です。商品化のキットにはまだなっていません。

HbA1cの特徴

血糖値と平行

血糖値が高いほど、グリコシル化ヘモグロビンが高くなるため、血糖値が反映できます。

形成が遅い

血糖値は常に変動しており、食事や糖代謝などの関連要因の影響を受けやすく、採血結果はそのときの血糖値のみを反映しています。グリコシル化ヘモグロビンが徐々に生成されるため、短期間の血糖値の増加（減少）はグリコシル化ヘモグロビンの増加（減少）を引き起こしません。また、空腹、採血時間、インスリン使用などの影響を受けないため、体内の血糖値をより正しく反映できます。