时间分辨荧光

免疫荧光是一种将抗原抗体结合反应与生物标记技术相结合的技术，在科研及临床上有着广泛的应用。普通的免疫荧光技术在对抗原含量进行测定时存在一定的局限性，在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，用普通荧光素来检测生物样品时，蛋白质本身产生的荧光会对实验产生干扰，实验检测的灵敏度严重下降。为了解决这一问题，1983年SOINI和KOJOLA提出以镧系元素标记为示踪螯合物和荧光测量相结合，建立了时间分辨荧光分析技术。时间分辨方式的免疫荧光分析方法可以对蛋白质、酶以及同位素等物质进行标记，并且不再受检测物种自然荧光的干扰。

技术原理

镧系元素共有15中，常用的有4中：钐（SM），铕（Eu），镝（Dy）,锝（Te）。镧系元素的半衰期很长（介于10-1000us之间，背景物质的半衰期为1-10ns），利用镧系元素的荧光特点，通过延长检测时间，在待测样品中短寿命的自然荧光完全衰变后再进行检测，即可将特异性荧光与非特异性荧光分辨开来。

荧光信号衰变时间对比

图1：荧光信号衰变时间对比

在POCT领域，免疫荧光平台最常用的就是时间分辨免疫荧光，其实验原理如下：当将含有待测抗原（抗体）的样品滴在加样区，待测样品中的抗原（抗体）与结合垫中的荧光纳米微球标记的抗体（抗原）结合并通过毛细作用向前层析，当达到检测区后，与检测线上固定的抗体（抗原）结合，形成微粒-抗体-抗原-抗体夹心复合物并被固定在检测线上，而多余的荧光微球标记物继续向前层析，与固定在质控线二抗结合。反应结束后，用紫外光源（365nm）对检测区扫描检测，检测线和质控线上荧光纳米微球发出高强度的荧光（615nm），且衰变时间也较长。延缓测量时间，待样品基质中自然发生的短寿命荧光（1-10ns）全部衰变后，再测量稀土元素的特异性荧光。通过检测线和质控线荧光强度的强弱及其比值，即可分析出样品中待测物的浓度。

时间分辨荧光技术原理

图2：时间分辨荧光实验原理

镧系元素特点

时间分辨荧光免疫分析法之所以能够继酶免、放免、化学发光后成为一种更新、更灵敏的检测方法，主要取决于它用镧系元素物理及化学性质。

寿命长

镧系元素拥有极长的荧光衰退时间（例如铕元素衰退时间为730000ns，钐元素衰退时间为50000ns），通过延长检测时间即可消除实验的本底干扰。

Stockes位移大

StoKes位移是指激发光谱与发射光谱之间的光谱波峰的波长差。波长差越大，越容易将两个波长区分开来，排除干扰。例如铕的激发光波长340nm，发射光波长613nm，两者之间的波长差为273nm，所以激发光和发射光很容易用干涉滤光片分靠。而普通荧光物质的激发光与发射光之间的波长差为28nm，那就很难排除激发光对发射光的干扰，影响检测结果。

特异性强

镧系元素的发射光谱很窄（615±5nm），狭窄的发射峰，通过波长分辨，很容易将特异性与非特异性荧光分辨开来。